G蛋白活性检测试剂盒信息推荐「武汉纽斯特」

试剂准备

?1X测定/裂解缓冲液：短暂混合5X储备液，并在去离子水中稀释至1X。 在使用前，添加蛋白酶抑制l剂，例如1 mM PMSF，10 μg / mL亮肽素和10 μg / mL抑肽酶。

1.将细胞（一块10厘米长的平板，约107个细胞）培养至约80-90％汇合。根据需要用活化剂或抑制l剂刺激细胞。

2.吸出培养基，并用冰冷的PBS洗涤两次。

3.完全除去PBS洗涤液，然后向细胞中加入冰冷的1X分析/裂解缓冲液（每10 cm组织培养板0.5-1 mL）。

4.将培养板放在冰上10-20分钟。

5.用刮板将其从平板上取下。

6.将裂解物转移至适当大小的试管中，并置于冰上。

7.如果发生核裂解，则细胞裂解液可能变得非常粘稠，难以移液。如果发生这种情况，可将裂解液通过27?号注l射器针头3-4次以剪切基因组DNA。

8.通过离心10分钟（在4°C下为12,000 x g）清除裂解物。

9.收集上清液并将样品（约1-2 mg的总蛋白）存储在冰上以立即使用，或速冻并存储在-70°C以便将来使用。

免l疫印迹和检测（所有步骤均在室温下搅拌）

1.在电印迹步骤之后，将PVDF膜浸入100％甲l醇中15秒钟，然后使其在室温下干燥5分钟。注意：如果使用硝l酸纤维素代替PVDF，则应跳过此步骤。

2.在室温下不断搅拌下，在TBST中用5％脱脂奶粉或3％BSA封闭膜1小时。

将膜与抗Arf 6兔多克l隆抗l体在5％脱脂奶粉或3％BSA / TBST中以1：50?1000（取决于样品中Arf 6蛋白质的量）新鲜稀释，孵育1-在室温下持续搅拌2小时或过夜4oC。

3.用TBST将印迹的膜清洗3次，每次5分钟。

4.将膜与二抗（例如山羊抗兔IgG，HRP偶联物）一起孵育，在室温下以恒定的比例在5％脱脂奶粉或3％BSA / TBST中以1：1000的比例新鲜稀释。搅动。

5.用TBST将印迹的膜清洗3次，每次5分钟。

6.使用您选择的检测方法，例如ECL。

当前没有直接测定法来测量Arl1 GTPases的激l活。

NewEast Biosciences Arl1激l活检测试剂盒基于特定于配置的单克l隆抗l体，该抗l体特异性识别Arl1-GTP，但不能识别Arl1-GDP。 鉴于单克l隆抗l体对其抗原的高度亲和力，可以在短时间内进行激l活测定。 该测定法可提供可靠的结果，并具有一致的可重复性。

 1.抗活性的Arl1，小鼠单克l隆抗l体（货号26924）：一小瓶–溶于pH 7.4的PBS中的22 μL（1mg / ml），含有50％甘油和0.05％叠氮l化钠。该抗l体特异性识别所有脊椎动物的Arl1-GTP。

2.蛋白A / G琼脂糖（目录号30301）：一小瓶– 400 μL 50％浆液。

3. 5X测定/裂解缓冲液（目录号30302）：一瓶– 30 mL的250 mM Tris-HCl，pH 8，750mM NaCl，50 mM MgCl2，5 mM EDTA，5％Triton X-100。

4.抗Arl1，小鼠单克l隆抗l体（目录号26056）：一小瓶– 100 μL（1 mg / ml）

pH 7.4的PBS中含有50％的甘油。

5. 100 XGTPγS（货号30303）：1瓶– 100 μl，10 mM，使用5 μLGTPγSGTP标记的0.5 mL细胞裂解物。

6. 100 X GDP（产品目录号30304）：一个样品瓶– 100 μl，100 mM，使用5 μL GDP

GDP标记的0.5 mL细胞裂解物。

1.刺激的和非刺激的细胞裂解液

2.蛋白酶抑制l剂

3. 4°C管摇杆或摇床

4. 0.5 M EDTA，pH8.0

5. 1 M氯化镁

6. 2倍还原SDS-PAGE样品缓冲液

7.电泳和免l疫印迹系统

8.免l疫印迹洗涤缓冲液，例如TBST（10 mM Tris-HCl，pH 7.4，0.15 M NaCl，0.05％Tween-20）

9.免l疫印迹封闭缓冲液（TBST包含5％脱脂奶粉或3％BSA）

10. PVDF或硝l酸纤维素膜

11.二抗

12. ECL检测试剂